Spaniny to białka, które są kodowane przez geny znajdujące się w kasecie litycznej bakteriofagów zaraz za tymi, które kodują holinę i endolizynę. Są one odpowiedzialne za uszkodzenie błony zewnętrznej, a więc są typowe dla Gram-ujemnych komórek bakteryjnych.

Opis spanin

Termin „spanina” został zaproponowany dla białek Rz i Rz1 (które zostały poznane jako pierwsze), ponieważ są to białka, które znajdują się kolejno w błonie wewnętrznej i błonie zewnętrznej tworząc kompleks rozciągający się przez całą peryplazmę. Białka te zostały zidentyfikowane jako produkty genów faga lambda.

Spaniny są białkami, które biorą udział już w ostatnim etapie lizy w przypadku bakterii Gram-ujemnych, ponieważ uszkadzają błonę zewnętrzną. Znamy dwa rozwiązania molekularne z udziałem tych białek:

1. dwukomponentowe spaniny
   • lipoproteina w błonie zewnętrznej (o-spanina)
   • białko zintegrowane z błoną wewnętrzną (i-spanina)
2. jednocząsteczkowa spanina (u-spanina)

U-spanina posiada część lipoproteinową znajdującą się w błonie zewnętrznej i C-końcową domenę transmembranową (TMD), która znajduje się w błonie wewnętrznej.

Początkowo uważano, że spaniny spełniają tylko funkcję pomocniczą w lizie, ponieważ ich brak w warunkach laboratoryjnych nie skutkował brakiem lizy. Do jej zahamowania dochodziło w momencie, gdy do hodowli bakteryjnej dodano jony Ca²⁺, albo Mg²⁺, co stabilizowało błonę zewnętrzną.

Za pomocą kriomikroskopi elektronowej (KrioEM) pokazano, że komórki bakteryjne zainfekowane fagami z mutacją typu null w genach Rz i Rz1 są pozbawione peptydoglikanu, zmieniają kształt z formy pałeczkowatej na sferyczną i nie obserwuje się u nich dynamicznej lizy, jaka powinna zajść. Wskazuje to na istotną rolę spanin w lizie komórek bakteryjnych, u których obecna jest błona zewnętrzna.

Podczas eksperymentów laboratoryjnych można było zaobserwować lizę prawdopodobnie dlatego, że na sferyczną formę komórki (która była bardziej wrażliwa) działały różne siły, które uszkadzały błonę zewnętrzną. Dopiero obrazowanie mikroskopowe pozwoliło udowodnić istotną rolę spanin.

Białko Rz

Jest to integralne białko błonowe zbudowane z 153 aminokwasów (aa). Około 130 reszt budujących to białko znajduje się w peryplazmie. C-końcowa domena peryplazmatyczna zbudowana jest z 2 alfa-helis. Białko to akumuluje się w formie dimeru i jest stabilizowane przez wewnątrzcząsteczkowe wiązania disulfidowe. Badania pokazały, że w warunkach in vitro wiązanie to nie jest konieczne dla Rz do dimeryzacji.

Białko Rz1

Lipoproteina (prolipoproteina) o długości 60 aa. Jest ona zakotwiczona w wewnętrznej części zewnętrznej błony komórkowej. W dojrzałej lipoproteinie nie ma domeny TMD, dlatego przypuszcza się, że lipidowa część Rz1 jest zakotwiczona w błonie zewnętrznej, podczas gdy część białkowa znajduje się w peryplazmie. Tak jak białko Rz akumuluje się w formie dimeru połączonego międzycząsteczkowym wiązaniem disulfidowym (w tym przypadku jednak wiązanie to jest niezbędne do dimeryzacji). W sekwencji dojrzałej formy białka Rz1 z 40 aa obecnych jest aż 10 prolin, z czego 5 z nich występuje bezpośrednio po sobie. Region ten spełnia istotną funkcję w aktywności Rz1.

Mechanizm działania

Domeny peryplazmatyczne obu białek wchodzą ze sobą w interakcję, co powoduje utworzenie heterotetramerycznego kompleksu o pałeczkowatym kształcie, który jest rozciągnięty przez całą peryplazmę przechodząc przez peptydoglikan. Przypuszcza się, że taki kompleks jest uwięziony w peptydoglikanie a dyfuzja horyzontalna jest zablokowana. Dopiero degradacja peptydoglikanu przez endolizyny pozwala na zmianę konformacyjną kompleksu spanin i uformowanie struktury podobnej do spinki do włosów (hairpin), co prowadzi do fuzji błony zewnętrznej i wewnętrznej (Ryc. 1).

gp11

Jednocząsteczkowa spanina (u-spanina) pochodzi od bakteriofaga T1. Lipoproteinowa część znajduje się w błonie zewnętrznej a C-koniec białka zakotwiczony jest w błonie wewnętrznej komórki bakteryjnej. Struktura II-rzędowa składa się w 14% z alfa-helis i w 31% z beta-kartek. Degradacja peptydoglikanu pozwala na późniejszą dyfuzję gp11, co umożliwia  oligomeryzację. Znaczne zmiany w strukturze II-rzędowej prowadzą do zmniejszenia dystansu pomiędzy błonami prowadząc do ich fuzji.

Sposoby zapisu genów spanin z genomie fagowym

W przypadku dwucząsteczkowych spanin istnieją trzy różne sposoby kodowania o-spaniny i i-spaniny w genomie fagowym:

• Dwa geny kodujące te białka mogą być w sobie zagnieżdżone (np. u faga lambda i T7)
• Dwa geny mogą na siebie nachodzić (u faga P2 gen kodujący o-spaninę wychodzi poza gen kodujący i-spaninę)
• Dwa geny mogą być oddzielone (np. u faga T4)

U-spaniny są produktem pojedynczego genu.

Bakteriofagi nieposiadające spanian

Niektóre bakteriofagi znalazły w drodze ewolucji sposoby na dezintegrację błony zewnętrznej bez potrzeby posiadania spanin.

Część bakteriofagów posiada endolizyny z aktywnością przenikania przez błonę. Fagi φKMV-podobne wytwarzają endolizyny, które na C-końcu zawierają dodatnio naładowaną domenę ze strukturą przewidzianą jako amfipatyczną helisę.

Inny przypadek (jak dotąd jest to pojedynczy przykład) można dostrzec w fagu φKT. Białko Gp28, które jest 50-aa kationowym polipeptydem posiada w przeważającej części strukturę amfipatycznej helisy. Ma silne powinowactwo do błon i głównie lokalizuje się w błonie zewnętrznej. Sprawdzono, że to białko w pełni zastępuję spaninę.

Literatura

1. Abeysekera, G. S., Love, M. J., Manners, S. H., Billington, C., & Dobson, R. C. (2022). Bacteriophage-encoded lethal membrane disruptors: Advances in understanding and potential applications. Frontiers in Microbiology, 13. DOI: 10.3389/fmicb.2022.1044143
2. Aslam, B., Arshad, M. I., Aslam, M. A., Muzammil, S., Siddique, A. B., Yasmeen, N., … & Baloch, Z. (2021). Bacteriophage proteome: insights and potentials of an alternate to antibiotics. Infectious Diseases and Therapy, 10(3), 1171-1193. DOI: 10.1007/s40121-021-00446-2
3. Berry, J., Rajaure, M., Pang, T., & Young, R. (2012). The spanin complex is essential for lambda lysis. Journal of bacteriology, 194(20), 5667-5674. DOI: 10.1128/JB.01245-12
4. Cahill, J., & Young, R. (2019). Phage lysis: multiple genes for multiple barriers. Advances in virus research, 103, 33-70. DOI: 10.1016/bs.aivir.2018.09.003
5. Grabowski Ł, Łepek K, Stasiłojć M, Kosznik-Kwaśnicka K, Zdrojewska K, Maciąg-Dorszyńska M, Węgrzyn G, Węgrzyn A. (2021) Bacteriophage-encoded enzymes destroying bacterial cell membranes and walls, and their potential use as antimicrobial agents. Microbiological Research; 248:126746. DOI: 10.1016/j.micres.2021.126746