Ostatni mechanizm oporności bakterii na antybiotyki jaki omówimy, to zmiany w ścieżce metabolicznej przez modyfikację w sieci regulatorowej. Przedstawimy kilka przykładów oporności na chinolony, wankomycynę i ampicylinę razem z ich omówieniem. W innym artykule porozmawiamy jeszcze o biofilmach.

Podział działania enzymów

Zmiana w ścieżce metabolicznej może dotyczyć tworzenia enzymów, które będą oddziaływać ze środkami antymikrobiologicznymi, modyfikacji celu bądź źródła pozyskania komponentu potrzebnego bakterii do przeżycia. W związku z tym możemy podzielić poszczególne mechanizmy działania na:

• ochronę celu,
• modyfikację miejsca docelowego,
• zastąpienie, albo ominięcie miejsca docelowego (1).

Stosując się do tego podziału omówimy kolejne przykłady działania niektórych mechanizmów oporności w obrębie zmian metabolicznych.

Ochrona celu

Geny kodujące białka pośredniczące ochronie celu w większości znajdują się na mobilnych elementach genetycznych (MEG). Omówimy sobie dwa najlepiej przebadanych przykładów mechanizmu obrony miejsca docelowego, czyli oporność na tetracyklinę wywołaną czynnikami Tet(M) i Tet (O) oraz oporność na chinolony spowodowaną obecnością cząsteczki Qnr (1, 2).

Oporność na tetracyklinę

Obecność białek Tet(M) i Tet(O) determinuje oporność na tetracyklinę. Należą one do nadrodziny czynników translacyjnych GTPaz. Fynkcyjnie są homologami czynników elongacji EF-G i EF-Tu (1, 3, 4).

Tet(O) i Tet(M) oddziałują z rybosomem i usuwają tetracyklinę z miejsca, do którego antybiotyk się wiąże w sposób zależny od GTP. Tet(M) oddziałuje z rybosomem między domeną IV 16S rRNA a miejscem wiązania tetracykliny (Ryc. 1.) bezpośrednio usuwając tetracyklinę z rybosomu. Ta interakcja prowadzi do zmiany konformacyjnej, co zapobiega ponownemu przyłączeniu się antybiotyku. Tet(O) też współzawodniczy z tetracykliną o miejsce wiązania i zmienia jego kształt – przesuwa antybiotyk z rybosomu, dzięki czemu może zachodzić dalsza synteza białek.

Oporność na chinolony

Za oporność na chinolony odpowiada cząsteczka Qnr. Geny kodujące tę cząsteczkę znajdują się na plazmidzie i często izoluje się je ze szczepów szpitalnych takich jak Klebsiella pneumoanie i Enterobacter spp.

Qnr konkuruje o miejsce wiązania DNA z gyrazą DNA i topoizomerazą IV. Uważa się, że zmniejszenie interakcji gyraza DNA- DNA jest powodem zmniejszenia zdolności cząsteczki chinolonu do tworzenia i stabilizacji kompleksu z DNA. Powodują niską oporność na chinolony i często występują u ESBL (Extended Spectrum Beta Lactamases). Dotąd opisano kilka alleli qnr: qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, qnrV (1, 2).

Modyfikacja miejsca docelowego

Jest to kolejny szeroko rozpowszechniony wśród bakterii mechanizm oporności na antybiotyki. Działa na niemal wszystkie rodziny związków antymikrobiologicznych.

Modyfikacja miejsca docelowego może odbyć się poprzez:

• mutacje punktowe w obrębie genu kodującego miejsce docelowe,
• enzymatyczne zmiany miejsca wiążącego (np. dodanie grupy metylowej),
• zastąpienie, albo ominięcie oryginalnego celu.

Mutacje w miejscu docelowym

Pojedyncze zmiany w genach kodujących cząsteczki, na które działa dany lek może spowodować lekkie albo znaczne obniżenie powinowactwa do celu. Zmiany w podjednostce polimerazy oraz gyrazy DNA i topoizomerazy IV, to przykłady na których się skupimy (1).

Oporność na fluorochinolony

Tutaj za przykład posłuży nam oporność na fluorochinolony. Te antybiotyki wpływają na replikację DNA przez zahamowanie dwóch istotnych enzymów: gyrazy DNA i topoizomerazy IV (geny kodujące te enzymy to odpowiednio: gyrA, gyrB; parC, parE). Te enzymy są istotne w naprawie DNA oraz w replikacji. Oporność na fluorochinolony pojawia się w większości przypadków w wyniku spontanicznych mutacji w genach gyrA oraz parC. Prowadzą one do zmian w sekwencji aminokwasowej w obrębię regionu 5′ wiązania chinolonów (1, 2).

Oporność na rifampicynę

Rifampicyna to antybiotyk, który hamuje polimerazę RNA zależnej od DNA. Ta polimeraza to enzym o strukturze podjednostki α₂ββ’σ. Kieszeń wiążąca rifampicynę to silnie konserwowana struktura, która mieści się w podjednostce β polimerazy RNA (kodowana przez gen rpoB). Po związaniu cząsteczka antybiotyku przerywa transkrypcję przez bezpośrednie zablokowanie ścieżki powstającego RNA.

W genie rpoB może dojść do mutacji punktowych, które spowodują zamianę pojedynczego aminokwasu. Taka mutacja wpływa na zmniejszenie powinowactwa leku do celu bez znacznego wpływu na działanie polimerazy. Jest to wysoki poziom mutacji na ten antybiotyk (1).

Enzymatyczne zmiany miejsca docelowego

Najczęściej podawanym przykładem jest metylacja. Poniżej omówimy przykład oporności spowodowaną występowaniem genów erm (np. oporność na makrolidy) i cfr (oporność np. na streptograminę A).

Oporność na makrolidy

W tym przypadku może dojść do metylacji rybosomu. Ta reakcja może być katalizowana przez enzymy kodowane przez geny erm (ang. erythromycin ribosomal methyllation – rybosomalna metylacja erytromycyny), w wyniku której powstaje oporność na makrolidy.

Te enzymy dodają jedną, albo dwie grupy metylowe do reszty adeniny w pozycji A2058 domeny V 23S rRNA w podjednostce 50S rybosomu. W wyniku zmiany biochemicznej wiązanie środka przeciwdrobnoustrojowego z celem jest upośledzone.

Scharakteryzowano ponad 30 genów erm i znaleziono je w ponad 30 różnych rodzajach bakterii. Wiele z nich zlokalizowano na MEG. U gronkowców najpowszechniej występują geny ermA (głównie u MRSA) i ermC (na plazmidach u MSSA) (1, 2).

Oporność na linezolid, linkozamidy i inne antybiotyki

Kolejnym ciekawym przykładem oporności ze zmianą w miejscu docelowym jest oporność na linezolid za pośrednictwem Cfr. Gen cfr ma pochodzenie plazmidowe. Koduje on enzym Cfr, który należy do rodziny metylaz S-adenozylo-L-metioniny (SAM). Poza tym odpowiada za występowanie oporności na fenikole, linkozamidy, pleuromutiliny i streptograminę A. Jak dotąd nie stwierdzono, aby geny cfr miały powodować oporność na tedizolid (antybiotyk zaaprobowany przez FDA w 2014 roku).

Zastąpienie lub całkowite ominięcie miejsca docelowego

Bardzo istotnym przykładem będzie oporność S. aureus na metycylinę (zmiany w PBP – Penicillin-Binding Protein) i enterokoków na wankomycynę (geny van zmieniające strukturę PGN).

Oporność na metycylinę

Enzymy PBP są istotne w syntezie ściany komórkowej bakterii. Odpowiadają za transpeptydację i transglikozylację jednostek PGN. Bakterie S. aureus oporne na metycylinę posiadają gen mecA, który koduje PBP2a, który w przeciwieństwie do PBP ma niskie powinowactwo do Beta-laktamów w tym penicylin, cefalosporyn (z wyjątkiem nowej generacji), i karbapenemów.

Gen mecA jest częścią kasety genowej wstawionej do MEG (Staphylococcal cassette chromosome – SCC mec). Podstawowe elementy tej kasety to: mecA, mecR1 (koduje białko przekaźnika sygnału MecR1), mecI (koduje białko represorowe Mec1) i ccr (koduje rekombinazę; ang. casette chromosome recombinase – rekombinaza kasety chromosomowej).

Jak działa system regulacyjny kasety? Białko represorowe Mec1 i białko przekaźnika sygnału MeR1 regulują ekspresję mecA. Gdy MecR1 wykryje obecność Beta-laktamów w otoczeniu, to wysyła kaskadę sygnałową by usunąć represor Mec1 z miejsca wiązania DNA. To rozpoczyna transkrypcję mecA oraz jego genów regulatorowych. Kończy się to tworzeniem PBP2a.

Oporność na wankomycynę

Glikopeptydy doprowadzają do śmierci komórki bakteryjnej przez zahamowanie syntezy ściany komórkowej. Wiążą się z prekursorem pentapeptydu w części D-Ala-D-Ala (Ryc. 2.) przez co nie może dojść do usieciowania PGN – brak miejsca przyłączenia dla PBP (1, 5). Jest to typ oporności występujący szczególnie często u Enterococcus faecium. Ten typ oporności zwykle nie występuje samodzielnie.

Za oporność na wankomycynę odpowiada klaster genów van. Ich produkty przebudowują syntezę PGN. Zmieniają ostatnią (5-tą) D-Ala na D-Laktat (wysoki poziom oporności) albo D-Serynę (niski poziom oporności). Wankomycyna nie jest w stanie przyłączyć się efektywnie do prekursora budowy ściany komórkowej po takich zmianach.

Do dziś opisano 9 różnych genów van (vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG, vanL, vanM, vanN). Klaster genów van ADLM syntetyzuje prekursor z D-Lac , natomiast klaster van CEGN z D-Ser. Geny van zwykle kodowane są na MEG, ale można je też znaleźć w chromosomie bakteryjnym (1).

Oporność na Trimetoprim-Sulfametaksazol (TMP-SMX)

Typowy przykład oporności z wykorzystaniem ominięcia szlaku przez zwiększenie produkcji czynnika, na który środek przeciwdrobnoustrojowy działa jest dobrze opisany w przypadku oporności na TMP-SMX. Ten środek wpływa na produkcję kwasu foliowego, który jest niezbędny chociażby do syntezy puryn. Większość bakterii nie potrafi pozyskać kwasu foliowego z zewnątrz, dlatego jego niedobór prowadzi do śmierci komórki.

Do syntezy kwasu foliowego bakteria potrzebuje takich enzymów jak: syntaza kwasu dihydropterowego (DHPS) na którą działa SMX i reduktaza dihydrofolianowa (DHFR) na którą działa TMP. W obrębie regionu promotora, gdzie znajdują się geny kodujące wymienione enzymy może dojść do mutacji, które wywołają nadekspresję tych genów. To oznacza, że powstanie większa ilość tych enzymów. Taka ilość będzie przytłaczająca dla TMP-SMX, dzięki czemu kwas foliowy będzie nadal syntetyzowany i komórka bakteryjna przeżyje.

Enterokoki wykorzystują trochę inną strategię, bo włączyły do swojego szlaku metabolicznego kwas tetrahydrofoliowy i kwas folinowy o pochodzeniu zewnętrznym (1, 2).

Literatura

1. Munita, J. M., & Arias, C. A. (2016). Mechanisms of antibiotic resistance. Virulence mechanisms of bacterial pathogens, 481-511. DOI: 10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015.
2. De Oliveira, D. M., Forde, B. M., Kidd, T. J., Harris, P. N., Schembri, M. A., Beatson, S. A., … & Walker, M. J. (2020). Antimicrobial resistance in ESKAPE pathogens. Clinical microbiology reviews, 33(3), e00181-19. DOI: https://doi.org/10.1128/CMR.00181-19.
3. Widdowson, C. A., & Klugman, K. P. (1998). The molecular mechanisms of tetracycline resistance in the pneumococcus. Microbial drug resistance, 4(1), 79-84. DOI:10.1089/mdr.1998.4.79.
4. Chukwudi, C. U. (2016). rRNA binding sites and the molecular mechanism of action of the tetracyclines. Antimicrobial agents and chemotherapy, 60(8), 4433-4441. DOI:10.1128/AAC.00594-16.
5. Arbeloa, A., Hugonnet, J. E., Sentilhes, A. C., Josseaume, N., Dubost, L., Monsempes, C., … & Arthur, M. (2004). Synthesis of mosaic peptidoglycan cross-bridges by hybrid peptidoglycan assembly pathways in gram-positive bacteria. Journal of Biological Chemistry, 279(40), 41546-41556. DOI:10.1074/jbc.M407149200.