Fagi i bakterie staczają ciągłą walkę ewolucyjną. Mimo, że wykorzystują enzymy bakteryjne do produkcji wirionów potomnych, to często w swojej sekwencji nukleotydowej kodują wiele produktów białkowych, które są bardziej wydajne, niż te należące do gospodarza. Genomy fagów też są małe, a więc i białka przez nie produkowane zwykle są mniejsze, co może ułatwić proces ich nadprodukcji. Właśnie takie enzymy można spotkać, np. w przemyśle biotechnologicznym. W tym artykule omówię kilka przykładów takich enzymów, z których mniej bądź bardziej rutynowo korzysta się w praktyce laboratoryjnej.

Podział enzymów

Najpierw przybliżmy sobie enzymy, jakie występują u fagów i zobaczmy, które z nich mają zastosowanie w biologii molekularnej, a które w innej kategorii.

• Polimerazy
• Ligazy
• Kinazy
• Helikazy
• Holiny, pinholiny
• Endolizyny
• Depolimerazy
• Spaniny
• Lizozymy
• ATPazy
• SSB
• Odwrotne transkryptazy
• Endopeptydazy
• Egzopeptydazy

Czy to są wszystkie enzymy? Nie, ale wydaje się, że te najbardziej powszechne. W miarę zdobywania wiedzy z zakresu enzymów stosowanych w biotechnologii, pewnie rozwinę ten wątek i pojawi się tu więcej przykładów.

Endolizyny, czy depolimerazy mogą znaleźć zastosowanie w terapii fagowej. Lizozym, np. z faga T7 to w zasadzie endolizyna, nazwana kiedyś lizozymem. Jednak lizozym faga T7 ma jeszcze jedną funkcję poza degradacją peptydoglikanu. Wiąże się on z polimerazą RNA faga T7.

Dlaczego enzymy bakteriofagowe są tak powszechne w biotechnologii?

Przyglądając się enzymom dostępnym w różnych firmach produkujących i sprzedających enzymy potrzebne do codziennej pracy w laboratorium można natknąć się takie pochodzenia bakteryjnego, jak np. polimeraza PFU (polimeraza bakterii Pyrococcus furiosis), ludzkiego, czy też bakteriofagowego [1].

Z niektórych enzymów korzysta się szczególnie często, jak np. ligaza faga T4 i są one standardem w pracy laboratoryjnej. Jaką przewagę mają enzymy fagowe nad innymi, dlaczego tak często z nich korzystamy? Odpowiedzi możemy poszukać w biologii bakteriofagów. W wyniku ewolucji, jaka stale narasta pomiędzy fagami a bakteriami, to fagi muszą być zdolne do przechytrzenia gospodarza. Muszą one dostać się do wnętrza komórki bakteryjnej, gdzie podczas cyklu litycznego w szybkim tempie muszą zreplikować swój genom, poskładać wiriony potomne w całość i uwolnić się z komórki doprowadzając do jej degradacji, by rozpocząć kolejny cykl infekcyjny. Cykl rozwojowy fagów jest ściśle skorelowany z cyklem rozwojowym gospodarza. Niektóre bakterie, np. Enterococcus faecalis namnażają się w wolnym tempie. Fagi lityczne, które są bardziej zjadliwe, nie mogą ograniczyć się do skorzystania z całej maszynerii bakterii, tylko wykorzystać własne białka, które pomogą im się w szybkim tempie namnożyć.

Fagi są dużo mniejsze od wirusów, ich genomy także. Można zauważyć, że białka, które zapisane są w genomie fagowym zwykle składają się z mniejszej liczby aminokwasów i często z pojedynczych podjednostek, jak np. polimeraza phi29. Zbudowane są też tak by działać błyskawiczne. Poza tym komercyjnie opłaca się nadprodukować te białka, ponieważ są stosunkowo proste w nadprodukcji i oczyszczaniu na masową skalę. Na dodatek część enzymów fagowych jest łatwa w edycji i zmiana ta jest stabilna, dzięki czemu można tworzyć wiele wariantów jednego enzymu. Za przykład może posłużyć ligaza DNA T4, które posiada warianty odporne na wyższe stężenia soli, wyższą temperaturę, itd. [3].

Przykłady poszczególnych enzymów i przykłady ich zastosowania

Enzymów pochodzenia fagowego jest wiele, a tutaj zaprezentuję kilka znanych mi przykładów, które można spotkać w codziennej pracy molekularnej. Wymienione są one w Tabeli1.

Tabela 1. Przykłady kilku enzymów pochodzenia bakteriofagowego, które znajdują zastosowanie w biotechnologii. W tabeli uwzględniono, czy dany enzym dostępny jest w firmie New England Biolabs (NEB), bądź w Thermo Fisher Scientific – dwóch firmach, z których naukowcy bardzo często korzystają w przypadku zakupu enzymów dobrej jakości.

Enzym	Pochodzenie fagowe	Firma	Główne zastosowanie	Uwagi
T4 DNA Ligase	T4	NEB, Thermo Fisher Scientific	ligacja DNA tępych i lepkich końców w dsDNA i przerwanych nici	obecnie w ofercie, standard w biotechnologii
T3 DNA Ligase	T3	NEB	ligacja przerwanych nici oraz lepkich końców wydajniej od T4, tażke tępych końców, ale już mniej wydajnie od T4 w dsDNA	obecnie w ofercie, rzadziej używany
T7 DNA Ligase	T7	NEB	ligacja przerwanych nici oraz lepkich końców w dsDNA	obecnie w ofercie, niszowy
T4 RNA Ligase	T4	NEB, Thermo Fisher Scientific	ligacja ssRNA/ssDNA i cyrkularyzacja ssRNA	obecny
T4 RNA Ligase 2	T4	NEB, Thermo Fisher Scientific	ligacja nacięć dsRNA i  ssRNA do ssRNA	szeroko stosowany w NGS
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	T4	NEB, Thermo Fisher Scientific	fosforylacja DNA/RNA w kierunku 5′, znakowanie DNA/RNA na końcach do sond i sekwencjonowania, usunięcie grup fosforylowych w kierunku 3′	standard
T7 RNA Polymerase	T7	NEB, Thermo Fisher Scientific	synteza mRNA,sgRNA, przygotowanie sondy RN znakowanej radioaktywnie, generowanie RNA do badań nad strukturą, przetwarzaniem, czy katalizą RNA	bardzo szeroko używany
T3 RNA Polymerase	T3	NEB, Thermo Fisher Scientific	Przygotowanie sondy RNA do hybrydyzacji, generownie mRNA dlasystemów trnslacji in vitro	dostępny
T4 DNA Polymerase	T4	NEB, Thermo Fisher Scientific	Wypełnianie luk, tworzenie tępych końców	standard
T7 DNA Polymerase	T7	NEB, Thermo Fisher Scientific	Mutgeneza miejscowo-specyficzna, wypełnianie luk	dostępny
T4 Gene 32 Protein (gp32, SSB)	T4	NEB, Thermo Fisher Scientific	stabilizacja ssDNA	dostępny
T7 Exonuclease	T7	NEB, Thermo Fisher Scientific	degradacja dsDNA	używany w Gibson Assembly
T4 Endonuclease V/VII	T4	NEB	nprawa DNA	specjalistyczne
phi29 DNA Polymerase	Bacillus subtilis bakteriofag phi29 (Φ29)	NEB, Thermo Fisher Scientific	amplifikacja izotermiczna, amplifikacja całego genomu	obecny w ofercie, bardzo ważny enzym

Bakteriofag T4, który jest litycznym wirusem infekującym komórki Escherichia coli, jest źródłem wielu enzymów, które mają powszechne zastosowanie w biotechnologii. Poza tym fagi z serii T są bardzo dobrze zbadane i opisane. Jak widać cała zestaw enzymów w tych fagach znajduje powszechne zastosowanie. Poniżej opiszę kilka przykładów enzymów bardziej szczegółowo.

Polimeraza DNA phi29

Polimeraza DNA φ29


pochodzi z bakteriofaga φ29 infekującego bakterię Bacillus subtilis. Enzym ten (białko p2) jest kluczowy dla replikacji materiału genetycznego wirusa, którego genom stanowi liniowe, dwuniciowe DNA o długości 19 285 par zasad [4].

Polimeraza φ29 jest enzymem składającym się z jednej podjednostki o masie ok. 66 kDa, posiadającym zarówno aktywność polimerazy DNA, jak i aktywność egzonukleazy 3’→5′, odpowiadającą za korektę błędów (ang. proofreading). Jedną z jej najważniejszych cech jest bardzo wysoka procesywność, czyli zdolność do syntezy bardzo długich fragmentów DNA bez odłączania się od matrycy. W badaniach wykazano, że enzym ten może syntetyzować nici DNA dłuższe niż 70 tys. par zasad w jednym cyklu przyłączenia do DNA [4, 5, 6]. Kolejną istotną właściwością jest zdolność do wypierania nici (strand displacement) podczas syntezy DNA, co oznacza, że enzym może rozplatać podwójną helisę bez udziału dodatkowych helikaz. Energia potrzebna do rozdzielenia nici pochodzi z reakcji przyłączania nukleotydów [4].

Replikacja DNA bakteriofaga φ29 zachodzi w sposób specyficzny – z udziałem białka terminalnego p3, które pełni rolę startera (primera). Synteza DNA rozpoczyna się na końcach liniowego genomu poprzez przyłączenie nukleotydu dAMP do białka terminalnego, a następnie polimeraza φ29 wydłuża powstającą nić, jednocześnie wypierając nić komplementarną. Mechanizm ten pozwala na ciągłą syntezę obu nici DNA z dwóch miejsc inicjacji, co określa się jako symetryczny model replikacji [4].

Polimeraza φ29 została ewolucyjnie przystosowana do pracy bez licznych białek pomocniczych – sama wykazuje wysoką procesywność i zdolność rozdzielania nici DNA, co umożliwia efektywną replikację wirusowego genomu w minimalnym układzie białkowym [4]. Obecność tak wydajnej polimerazy u bakteriofaga wynika z jego strategii namnażania. Wirusy bakteryjne muszą bardzo szybko kopiować swój genom w komórce gospodarza, wykorzystując ograniczoną liczbę własnych białek.

Struktura przestrzenna phi29

Polimeraza DNA φ29 należy do rodziny B i, podobnie jak inne polimerazy replikacyjne, ma architekturę „prawej dłoni” z poddomenami palm, fingers i thumb tworzącymi centrum polimerazowe [Berman, et al., 2007]. Część N-końcowa stanowi domenę egzonukleazową, a C-końcowa zawiera właściwą domenę polimerazową [Berman, et al., 2007]. Cecha wspólna z innymi polimerazami rodziny B to obecność konserwowanych motywów katalitycznych, mechanizm dwóch jonów metalu oraz funkcjonalny podział: palm katalizuje tworzenie wiązania fosfodiestrowego, fingers wiąże przychodzący dNTP, a thumb stabilizuje dupleks starter-matryca [7].

Od innych polimeraz B φ29 odróżnia przynależność do podgrupy protein-primed polymerases. Ma dwie dodatkowe poddomeny, TPR1 i TPR2, nieobecne w klasycznych polimerazach tej rodziny, np. RB69 [Berman, et al., 2007]. TPR2 wraz z palm i domeną egzonukleazową tworzy tunel dla nici matrycowej, co tłumaczy jej wysoką procesywność i zdolność do strand displacement [Berman, et al., 2007]. Strukturalnie wyróżnia ją też przystosowanie do inicjacji syntezy z użyciem białka terminalnego TP zamiast zwykłego startera nukleinowego [Berman, et al., 2007]. Charakterystyczne dla φ29 są także dwa konserwowane tyrozyny uczestniczące w translokacji, co odróżnia jej mechanizm od polimeraz rodziny A i części innych polimeraz B [7].

Ligaza DNA T4

Ligazy DNA są kluczowymi enzymami w procesach replikacji, naprawy i rekombinacji DNA, katalizując powstawanie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcami 3’-OH i 5’-fosforanowymi przeciętych nici DNA. U prokariotów dominują ligazy zależne od NAD+, natomiast u eukariontów, archaea i bakteriofagów T-serii, w tym T4, enzymy te są ATP-zależne. T4 DNA ligaza jest modelem do badań mechanizmu ATP-zależnych ligaz, gdyż jest relatywnie mała i konserwuje zestaw motywów katalitycznych typowych dla tej rodziny enzymów.

Badania funkcjonalne wykazały, że ligaza DNA T4 tworzy dwa rodzaje kompleksów z DNA: przejściowy, z adenylowanym enzymem, odpowiedzialny za skanowanie nici w poszukiwaniu 5’-fosforanowego końca, oraz stabilny – po transferze grupy adenylowej, w którym zdeadenylowany enzym pozostaje przy końcu DNA do momentu pojawienia się kompatybilnego 3’-OH. Mechanizm ten pozwala wyjaśnić wysoką skuteczność ligacji tępych końców oraz tzw. “reverse reaction” – relaksację supercoilowanych cząsteczek DNA w obecności AMP.

W przypadku bakteriofaga T4 obecność tak sprawnej ligazy DNA umożliwia skuteczną ligację fragmentów genomu po replikacji lub uszkodzeniach, co zapewnia wirusowi przewagę w namnażaniu w komórce gospodarza. W badaniach mutantów z delecją końców białka lub mutacją Lys159 w centrum aktywnym traciły aktywność adenylacji i ligacji, co wskazuje na krytyczną rolę zarówno domen katalitycznych, jak i sekwencji wiążących DNA w obydwu częściach cząsteczki. Dodatkowo, wykazano analogie pomiędzy ligazami a enzymami “cappingującymi” RNA, sugerujące ewolucyjny związek i złożone funkcje regulacyjne [8].

Na Ryc. 1. zaprezentowana jest struktura przestrzenna ligazy DNA T4 w kompleksie z DNA. Chociaż białko to zostało odkryte już dawno, to dopiero w 2018 r. ukazała się praca, która pokazuje strukturę białkową tego ciekawego enzymu [9].

W jakich firmach można kupić enzymy pochodzenia fagowego?

Firmy, jakie specjalizują się w sprzedaży enzymów to przede wszystkim New England Biolabs (Neb) [1], ThermoFisher Scientific [2], EURx [10], a nawet firma A&A Biotechnology [11]. Dwie ostatnie, to Polskie firmy zlokalizowane w Gdańsku. Natomiast dwie pierwsze wymienione firmy, to ogólnoświatowe wielkie koncerny, które gwarantują wysoką jakość produktu. Nie oznacza to jednak, że Polskie firmy nie potrafią im dorównać. Wiele produktów jest naprawdę dobrej jakości, bądź wystarczającej do analiz wykonywanych w laboratoriach.

Literatura

1. https://www.neb.com
2. https://www.thermofisher.com/pl/en/home/brands/thermo-scientific.html.html/1000
3. https://www.neb.com/en/tools-and-resources/selection-charts/properties-of-dna-and-rna-ligases
4. Blanco, L., Bernad, A., Lázaro, J. M., Martín, G., Garmendia, C., & Salas, M. (1989). Highly efficient DNA synthesis by the phage ϕ 29 DNA polymerase: symmetrical mode of DNA replication. Journal of Biological Chemistry, 264(15), 8935-8940. DOI:10.1016/S0021-9258(18)81883-X
5. Baner, J., Nilsson, M., Mendel-Hartvig, M., & Landegren, U. (1998). Signal amplification of padlock probes by rolling circle replication. Nucleic acids research, 26(22), 5073-5078. DOI:10.1093/nar/26.22.5073
6. Krzywkowski, T., Kühnemund, M., Wu, D., & Nilsson, M. (2018). Limited reverse transcriptase activity of phi29 DNA polymerase. Nucleic Acids Research, 46(7), 3625-3632. DOI: 10.1093/nar/gky190
7. Berman, A. J., Kamtekar, S., Goodman, J. L., Lazaro, J. M., de Vega, M., Blanco, L., … & Steitz, T. A. (2007). Structures of phi29 DNA polymerase complexed with substrate: the mechanism of translocation in B-family polymerases. The EMBO journal, 26(14), 3494. DOI:10.1038/sj.emboj.7601780
8. Rossi, R., Montecucco, A., Ciarrocchi, G., & Biamonti, G. (1997). Functional characterization of the T4 DNA ligase: a new insight into the mechanism of action. Nucleic acids research, 25(11), 2106-2113. DOI:10.1093/nar/25.11.2106
9. Shi, K., Bohl, T. E., Park, J., Zasada, A., Malik, S., Banerjee, S., … & Aihara, H. (2018). T4 DNA ligase structure reveals a prototypical ATP-dependent ligase with a unique mode of sliding clamp interaction. Nucleic acids research, 46(19), 10474-10488. DOI:10.1093/nar/gky776
10. https://eurx.com.pl/glowna/
11. https://www.aabiot.com/